FAQ Services

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1. Comment puis-je obtenir des informations sur l'évolution de mon projet en sciences de la reproduction ?

Nous vous tenons informé de l’évolution de votre projet par le biais de rapports édités à chaque étape majeure : réception de vos animaux ou de votre matériel biologique dans nos locaux, rapport de contrôle qualité des cryoconservations, naissance des petits, envoi de biopsies pour génotypage, confirmation du statut sanitaire SOPF, expédition des animaux à votre animalerie … .

Si toutefois vous souhaitez obtenir des informations complémentaires au cours du projet, vous pourrez en faire la demande par email à myproject@janvier-labs.com ou par téléphone au +33.(0)2.43.02.90.28. 

 

2. Aide générale sur les prestations de Sciences de la Reproduction en Elevage de rongeurs génétiquement modifiés.

Ce tableau vous présente quelques problématiques que vous pourrez rencontrer avec vos lignées et les solutions que JANVIER LABS propose.

 

 

3. Si je confie ma lignée à JANVIER LABS pour la réalisation d’une prestation, est ce que je perds mes droits de propriété intellectuelle sur les animaux d’origine ou sur les animaux produits ? 

Les animaux, embryons et produits biologiques utilisés par JANVIER LABS dans le cadre de prestations, et les droits de propriété intellectuelle y afférents demeurent la propriété et/ou sous le contrôle exclusif du client.

JANVIER LABS n’acquiert sur ces éléments, aucun droit de propriété intellectuelle et en particulier, aucun droit d’exploitation ou de commercialisation.

 

4. Les animaux ou le matériel biologique nécessaires pour la prestation seront fournis par un collaborateur d’un autre institut. Pouvez-vous gérer le processus de rapatriement ? 

Nous gérons toute la logistique relative au rapatriement de vos animaux ou de votre matériel biologique congelé depuis n’importe quelle partie du monde : prise de contact avec vos collaborateurs, gestion du transport,  documents pour la douane…

Nous assurons également la livraison d’animaux et de matériel biologique congelé dans n’importe quelle partie du monde, soit par le biais de notre propre service transport en Europe, soit par l’intermédiaire de transporteurs spécialisés dans le reste du monde.

 

5. Comment sont hébergés mes animaux chez JANVIER LABS ? 

Les animaux clients arrivent au laboratoire externe situé à 8 km du site d’élevage SOPF JANVIER LABS, et sont manipulés par du personnel dédié aux animaux non-SOPF. Au laboratoire externe, les animaux sont hébergés en cages ventilées et changés sous hotte à flux laminaire, évitant ainsi toute contamination entre les lignées des différents clients.

Après avoir été prélevés et préalablement lavés, les embryons sont transportés vers le laboratoire interne (distant de 8 km) par une équipe distincte pour leur stockage ou transfert en femelles pseudo-gestantes. Après transfert d’embryons, les femelles receveuses sont hébergées en isolateur pour une gestion optimum du statut sanitaire de chaque lignée.

Cette stratégie d’hébergement basée sur la séparation des animaux infectés et des animaux SOPF par barrières successives, offre des conditions optimales de redérivation et d’élevage au statut SOPF, sans risque de contamination.

 

6. Comment pouvez-vous m’aider si ma colonie a été infectée par un micro-organisme pathogène qui interfère dans mes résultats, et que j’ai besoin de terminer mon étude au plus vite ? 

Contactez-nous à myproject@janvier-labs.com pour tout conseil technique relatif à votre problème. Si vous avez besoin de 3-6 mâles et 3-6 femelles sains pour démarrer, une redérivation standard sera la solution la plus appropriée. Si vous avez besoin d’un nombre d’animaux plus important pour démarrer, nous vous recommanderons une expansion rapide de colonie. Cependant, pour une stratégie personnalisée et basée sur le génotype de votre modèle et vos besoins précis, n’hésitez pas à nous contacter par téléphone ou par email pour en discuter avec l’un de nos experts. 

 

7. Quels agents infectieux testez-vous relativement au statut SOPF ? Pouvez-vous effectuer des contrôles additionnels ? 

Le statut sanitaire SOPF est basé sur les recommandations FELASA qui standardise la liste des agents à tester pour le statut SPF (Specific Patrogen Free) et SOPF (Specific Opportunist and Pathogen Free). JANVIER LABS applique une politique sanitaire permettant de garantir un standard sanitaire maximum et a à cœur de fournir des produits de haute qualité pour la recherche (JANVIER LABS Health policy). Toutes les analyses sont effectuées par des laboratoires indépendants pour assurer une entière objectivité des résultats. Les animaux expédiés auront été testés pour les agents infectieux suivants (voir tableau). 

Si votre souche (rat ou souris) est particulièrement sensible à un agent qui ne serait pas inclus dans cette liste, nous pouvons organiser les tests en fonction. 

 

8. Comment les contrôles sanitaires sont-ils organisés au sein du Service Transgénique ?

JANVIER LABS fait faire ses contrôles sanitaires par des laboratoires indépendants pour contrôle du statut sanitaire SOPF standard. Pour les prestations de reproduction assistée, 2 femelles receveuses issues des transferts d’embryons servent de sentinelles. Ces femelles sont expédiées pour contrôle 8 semaines après le transfert des embryons. Suite à ce contrôle initial, et pour les projets d’élevage à façon, des sentinelles sont ensuite expédiées toutes les 13 semaines pour contrôle périodique des isolateurs maintenus pour une plus longue période (pour la liste des agents, cf FAQ 7).

 

9. Dans quel cas est-il nécessaire de choisir l'option d’identification pour génotypage ?

Dans plusieurs services tels que la redérivation et la revitalisation, une option d’identification génotypage vous est proposée. Cela consiste à marquer les petits par transpondeurs à 10 jours et faire une biopsie caudale des petits des portées obtenues. Nous vous expédions ces biopsies afin que vous puissiez faire un génotypage et sélectionner les animaux d'intérêts que vous souhaitez conserver. Nous vous proposons également d'effectuer le génotypage pour vous - un devis vous sera établi en conséquence. Il est important de préciser que pour une redérivation et une revitalisation avec ou sans fécondation in vitro, il y a une transmission mendélienne des allèles en dehors de toute influence des transgènes. Il convient donc de prendre en compte le génotype des mâles et des femelles utilisés.

Dans quel cas cela est-il nécessaire ? L’option d’identification pour génotypage est nécessaire si vous attendez des petits avec des génotypes variables et pour toute analyse où une identification animal par animal est requise. Par exemple, si une redérivation a été faite avec des mâles hétérozygotes de votre lignée et des femelles sauvages de chez JANVIER LABS, 50% des individus obtenus SOPF seront porteurs du transgène. Dans ce cas, pour le choix des 3-6 mâles et 3-6 femelles SOPF de la prestation de redérivation et s’il y a plus de 10 animaux redérivés, il peut être intéressant de faire ce génotypage pour optimiser au maximum la livraison d’animaux d’intérêt.

Il faut prendre en considération que nous garantissons 3-6 mâles et 3-6 femelles SOPF quel que soit le génotype. En fonction des animaux fournis ou utilisés, vous devez estimer le maintien de votre transgène à la descendance. Toutefois, dans la mesure du possible (transmission attendue à environ 50% sur le transgène principal), nous ferons en  sorte de vous fournir au moins deux mâles porteurs, s’il est avéré qu’il n’y a aucune influence de la lignée sur la transmission mendélienne du caractère génétique considéré.

 

 

 

10. Ma lignée n’a pas été maintenue correctement et ne se reproduira plus, étant donné l’âge avancé des animaux. Pouvez-vous m’aider ?

Oui, nous pouvons probablement vous aider à sauver votre lignée, même s’il ne vous reste qu’un mâle ou quelques femelles. Nous avons une grande expérience dans le sauvetage de lignées dont les animaux ont arrêté de se reproduire, et utilisons diverses méthodes. Gardant à l’esprit que les chances de succès dépendront toujours de l’âge des animaux, plus vite nous intervenons, plus nous aurons de chances de succès. La stratégie de sauvetage dépendra du genre des animaux que vous avez à votre disposition (cf. fiche technique sur le sauvetage de lignée).

 

11. Qu'est-ce que la fiche d'information projet ? 

Après acceptation de notre offre, nous vous envoyons par email une fiche d’informations à remplir. Cette fiche nous permet de recueillir toutes les informations requises pour la réalisation de votre projet (caractéristiques génétiques et phénotypiques de la lignée, contact client, type de prestation souhaitée, contrôle sanitaire, adresses de livraison, etc…) et de déclarer auprès des autorités compétentes, tous les organismes génétiquement modifiés présents sur notre site.

 

12. Quel est le nombre moyen de petits que je peux espérer obtenir en transfert d’embryons ?

Le graphique ci-dessous montre le nombre moyen de petits obtenus après transfert d’embryons provenant :

  • soit d’embryons directement collectés
  • soit  d’embryons congelés
  • soit d’embryons obtenus après une FIV (sperme frais ou congelé)

 

Le principe étant de transférer un nombre fixe d’embryons dans l’oviducte de femelles pseudogestantes et, à la naissance, de compter le nombre de petits obtenus. Le résultat est exprimé en pourcentage d’embryons donnant des petits par rapport au nombre total d’embryons transférés et ceci en fonction de différentes souches : Taux de naissance (données JANVIER LABS à partir d’embryons de lignées génétiquement modifiées ou du catalogue JANVIER LABS).

 

 

13. Pouvez-vous m’expliquer le délai de 11 semaines entre la réimplantation et la livraison des animaux SOPF ? 

Les animaux SOPF de votre lignée vous seront livrés à l’âge de 8 semaines environ, donc prêt à être accouplés.

Nous expédions les femelles receveuses pour contrôle sanitaire 8 semaines après leur entrée en isolateur (les petits ont 5 semaines lors de l’envoi de leur mère). Nous disposons ensuite d’un délai de 2 semaines pour réceptionner les résultats de contrôle sanitaire et valider le statut SOPF. A réception de ces résultats, nous planifions la livraison des animaux à votre animalerie. 

La prestation de redérivation par transfert d’embryons dure au total 11 semaines (J0 = transfert d’embryons < J0 + 3 semaines = naissance des petits < J0 + 11 semaines = livraison des animaux SOPF).

 

14. Je ne suis pas en mesure de vous fournir le nombre d’animaux requis pour une prestation de redérivation/cryoconservation. Y-a-t-il une alternative ?

Le nombre d’animaux prérequis a été défini afin de fixer des objectifs de restitution (nombre d’animaux SOPF ou nombre de paillettes de matériel congelé).

S’il ne vous est pas possible de fournir ces animaux pré-requis, nous pouvons adapter le projet de 2 manières :

  • en développant une colonie préalablement à la réalisation du service souhaité. Cela permet de conserver les objectifs de restitution.
  • en diminuant l’objectif de restitution, calculé en fonction du nombre d’animaux disponibles.

 

15. Pour quelle raison faut-il individualiser un mâle mature une semaine avant de l'accoupler ou de prélever son sperme ?

Le mâle (ou les mâles dominants) d'une cage inhibe la synthèse de testostérone des autres mâles et donc nuit à leur fertilité. Il faut donc les individualiser au moins une semaine pour éviter ce phénomène et rétablir la production de spermatozoïdes.

 

16. Est-il possible de décontaminer une lignée en passant par le sperme frais ou cryoconservé ?

La redérivation en passant par le sperme est tout à fait possible voir couramment utilisée, mais elle doit se faire selon des étapes et une procédure bien précise. En effet, il faut savoir que de nombreux agents tels que les virus sont retrouvés dans le sperme (Pour exemple : Agca et al., 2007 ; Janus et al., 2009). Pour cette raison, l’insémination directe d’une femelle (non contaminée) avec ce sperme ne permettra pas de décontaminer la lignée concernée pour ces agents infectieux.

Le principe sera donc d’aboutir à une décontamination par transfert d’embryons via une fécondation in vitro. En effet, la zone pellucide d’un embryon constitue une barrière infranchissable aux principaux contaminants et une décontamination s’obtient par lavage successif des embryons et transfert en femelles porteuses non contaminées (pour exemple : Suzuki et al., 1996 ; Van Keuren et Sanders 2004). Des études réalisées par Janus et al., 2009 et Mahabir et al., 2007 ont montré qu’il est plus difficile d’éliminer certains virus (notamment le MMV) et que des conditions plus maitrisées sont nécessaires. Toutefois, ces auteurs qui ont décrits ces risques (Mahabir et al., 2009 ; Mahabir et al., 2008 ; Peters et al., 2006) ont aussi démontré que même pour ces virus, une décontaminations via la FIV peut être efficace. Les étapes de décontamination via le sperme frais ou congelé pour assurer une décontamination efficace sont les suivantes (il est nécessaire à chaque étape de définir des barrières ou zones délimitées différentes):

  • Prélèvement de sperme ou décongélation de sperme de la lignée à décontaminer
  • Prélèvement d’ovocytes de femelles donneuses (quel que soit le statut sanitaire de ces femelles) et fécondation in-vitro avec le sperme de la lignée à décontaminer
  • Culture 24 h pour obtenir des embryons au stade 2 cellules
  • Lavage au moins 10 fois (selon recommandations de l’IETS)
  • Transfert en femelles pseudo-gestantes de statut sanitaire connu (exemple : SOPF)
  • Naissance des petits et élevage dans des conditions de maintien de ce statut sanitaire. Ces animaux ont maintenant les caractéristiques génétiques de la lignée d’où provient le sperme d’origine et des femelles donneuses d’ovocytes, avec le statut sanitaire de la mère porteuse (SOPF).

 

17. Votre objectif de restitution après redérivation par transfert d’embryons est de 3 à 6 mâles et 3 à 6 femelles SOPF. Comment identifiez-vous les animaux restitués ?

Nous restituons jusqu’à 6 mâles et 6 femelles SOPF de votre lignée, indépendamment du génotype. Si, suite au transfert d’embryons, nous avons obtenu plus de 6 mâles et 6 femelles de votre lignée et si cela est nécessaire, nous pouvons vous proposer l’option d’identification (voir FAQ : 9), qui consiste à identifier les animaux (par puce électronique), et de vous faire parvenir des biopsies pour génotypage. Ainsi, vous pourrez choisir les animaux les plus appropriés au développement de la colonie dans votre animalerie. Cette option vous sera facturée au tarif en vigueur.

 

18. Comment réceptionner des femelles gestantes issues d’une prestation de décontamination rapide par transfert d’embryons dans mon animalerie ?

Les femelles gestantes (environ 15j) vous seront livrées groupées dans un seul colis avec la date prévue de mises bas. Elles devront être individualisées à réception et du matériel de nidification devra être déposé dans la cage pour la confection du nid.

Les cages d’hébergement ne devront pas être changées avant la mise-bas pour éviter les risques d’avortement ou de cannibalisme.

 

19. Quels critères prendre en compte pour savoir si ma lignée doit être cryoconservée par le sperme ou l’embryon ?

Le choix de la technique de cryoconservation passe par la connaissance et l’analyse des caractéristiques de sa lignée. Les contraintes à prendre en compte sont imposées par les techniques de cryoconservation.

En effet, lors de la cryoconservation de sperme, seul le patrimoine génétique du mâle haploïde est conservé. La revitalisation impose une fécondation (in vitro) avec des femelles, en général, de même fond génétique mais de génotype sauvage pour la modification génétique. Les individus obtenus seront donc obligatoirement hétérozygotes pour la modification génétique. Pour cette raison, la gestion de lignée plus complexe (plusieurs mutations) est plus compliquée et hasardeuse avec cette technique. En effet, il y a une séparation des différents transgènes à la revitalisation en fonction du génotype des mâles utilisés pour la cryoconservation. Par contre, la cryoconservation de sperme est très simple et rapide, avec un coût plus faible et un potentiel d’obtention d’animaux à la revitalisation plus important que la cryoconservation d’embryons.

L’avantage de la cryoconservation d’embryons est de permettre de sauvegarder et de revitaliser l’ensemble des caractéristiques génétiques de la souche (ce qui est cryoconservé, est obtenu à la revitalisation). C’est pour cette raison que c’est une technique de choix pour la maitrise de la dérive génétique et la cryoconservation de lignées complexes (mutations multiples et maintien d’un fond génétique particulier).

JANVIER LABS vous conseille d’analyser les caractéristiques de votre lignée pour décider d’une  cryoconservation de sperme ou d’embryons. Si vous le souhaitez, nous pouvons faire ensemble cette analyse, et vous aider dans le choix de la méthode la plus adaptée.

Ce tableau vous donne un résumé des éléments à prendre en compte lors du choix entre une cryoconservation de sperme ou d’embryons. Nous pouvons vous aider dans ce choix n’hésitez pas à nous contacter à myproject@janvier-labs.com.

Paramètres

Cryoconservation du sperme (JAX™ Sperm Cryo Kit)

Cryoconservation de l’embryon

Matériel génétique cryoconservé

Haploïde

Diploïde

Le ou les transgènes

1-2

Plusieurs

Le fond génétique

Consanguin standard ou peu important

Original

Phénotype multifactoriel (interaction génétique)

Maitrisé

Adapté quel que soit le modèle

Le faire soi même

OUI

NON

Gestion du génotype à la première génération revitalisée

Hétérozygote

Selon la congélation (homozygote)

Gestion de la quantité à la revitalisation

+++

-

Coût de la cryoconservation

Faible

Important

Gestion de la quantité, du génotype et du coût

+++

+

Usage de la lignée

?

?

 

JAXTM is a trademark of The Jackson Laboratory registered in the United States. All rights reserved.

 

20. Pourquoi JANVIER LABS utilise la cryoconservation d’embryons par vitrification et non par congélation lente ?

La technique de cryoconservation d’embryons existe de façon fiable depuis le début des années 1980. La technique alors utilisée est la congélation lente (aussi appelé méthode équilibrée). Elle consiste à mettre les embryons dans un milieu cryoprotectant approprié et à abaisser la température progressivement. Ce procédé permet de congeler les embryons en évitant la formation de cristaux de glace dans la cellule qui aurait pour effet d’altérer et de tuer les cellules. La vitrification (aussi appelée méthode non-équilibrée) consiste à mettre les cellules dans un milieu cryoprotectant à haute concentration, ce qui a pour effet d’éviter la formation de glace extracellulaire et d’entrainer une perte d’eau intracellulaire. Les embryons sont ensuite plongés dans l’azote liquide. Cette congélation rapide permet de figer  l’embryon dans un état dit vitreux car l’eau « n’a pas le temps » de s’organiser en cristaux de glace.

La vitrification de façon efficace se développe ces dernières années car elle est plus rapide et plus simple (pas besoins de matériel pour la descente progressive en température nécessaire à la congélation lente). Il semble que cette technique agresse et altère la cellule de façon moins importante avec un effet moins invasif et perturbant du milieu intracellulaire des cellules. Pour exemple, cette technique permet aujourd’hui de proposer des solutions de cryoconservation d’ovocytes beaucoup plus efficace que la congélation lente.

Voici quelques références qui vous donneront un aperçu de la technique de vitrification et son efficacité dans la cryoconservation d’ovocytes et d’embryons pré-implantatoires : Nakao et al., 1997 ; Zander-fox et al. 2013 ; Vanderzwalmen et al. 2013 ; Kohaya et al., 2013 ; Nakagata et al., 2013 ; Rezazadeh et al., 2009 ;

JANVIER LABS a développé sur cette base un protocole et un service performant de cryoconservation d’embryons par la technique de vitrification. Nous vous proposons donc de cryoconserver les embryons de vos lignées par cette technique. Nous utilisons également la vitrification pour vous fournir des embryons congelés de nos souches JANVIER LABS à tous les stades du développement préimplantatoire pour notamment une utilisation en modification du génome murin (par exemple le QUICKBLASTO®).

 

21. Les embryons mis en paillettes puis congelés sont-ils préalablement décontaminés des éventuels germes présents sur ma lignée ?

OUI. Tout montage de paillettes se fait après lavage des embryons en milieux stériles et sous poste de sécurité microbiologique.

 

22. Quel pourcentage d’embryons viables je peux espérer en revitalisation d’embryons ?

Le graphique ci-dessous montre le pourcentage d’embryons au stade 2 cellules viables à la décongélation d’embryons préalablement congelés par JANVIER LABS en fonction des fonds génétiques(en bleu). Ces embryons sont mis en culture pour s’assurer de la reprise des activités biologiques jusqu’au stade 4 cellules (en rouge). En règle générale, sur 100 embryons décongelés, 60 à 90 embryons sont encore vivants (par observation en loupe binoculaire) et 50 à 70 % de ces embryons se développent au stade 4 cellules (données JANVIER LABS à partir de lignées souris génétiquement modifiés traitées par JANVIER LABS). Pour estimer le nombre de petits que l’on peut obtenir (taux de naissance), il faut transférer les embryons viables en femelles receveuses (voir FAQ 12).

 

23. Quelle est l’efficacité d’une FIV après congélation de sperme avec le JAX™ Sperm Cryo Kit ?

Le JAX™ Sperm Cryo Kit a été développé par le Jackson Laboratory sur la base d’une étude faite et publiée en 2008 dans le journal Plos One (Ostermeier et al., 2008). L’efficacité d’une cryoconservation de sperme est évaluée par la capacité de fécondation du sperme à la décongélation en fécondation in Vitro. La synthèse des résultats comparés dans la publication est présentée ci-dessous en tant que % d'ovocytes fertilisés pour atteindre le stade 2 cellules. Pour estimer le nombre de petits que l’on peut obtenir (taux de naissance), il faut  transférer les embryons issus de la FIV en femelles receveuses (voir FAQ 12).

JAX™ is a registered trademark of The Jackson Laboratory registered in the United States. All rights reserved.

 

24. Quels sont les intérêts et les avantages de la double prestation cryoconservation (sperme ou embryons) et décontamination par transfert d'embryons ?

 

Cette double prestation permet, en plus de redériver une lignée, d'en assurer sa sauvegarde sous forme congelée.

Un contrôle qualité in vivo des embryons congelés permettra la restitution d’individus SOPF de la lignée.

Une décontamination par transfert d’embryons produits par accouplements naturels, stimulera et permettra la vérification de la fertilité des mâles dont le sperme sera cryoconservé ultérieurement.

 

25. Comment choisir et interpréter un contrôle qualité en congélation de sperme ou d’embryons ?

La cryoconservation de germoplasme n’a d’intérêt (en général) que s’il est possible de réobtenir efficacement des individus viables et fertiles avec les caractéristiques génétiques souhaitées. De plus,  la constitution d’un stock de matériel congelé (banque de sperme ou d’embryons) n’implique pas une revitalisation à court terme. Il est donc indispensable de s’assurer que le matériel a été correctement congelé. C’est pour cette raison qu’un contrôle qualité de la congélation est nécessaire. Ce contrôle va consister à vérifier la viabilité du matériel cryoconservé avec le maintien des activités/fonctions biologiques. Le contrôle qualité a également l’intérêt de fournir les données indispensables pour une revitalisation future efficace.

Les contrôles qualité (QC) pour la cryoconservation de sperme

Ce tableau résume les avantages et les inconvénients de chaque contrôle qualité.

Contrôle qualité

Principe/Procédure

Avantages

Inconvénients

(risque à évaluer)

Sécurité du QC

Conseils JANVIER LABS

Analyse du sperme à la décongélation

Décongélation d’une paillette

Mesures de la mobilité, de la mortalité et de la  densité du sperme

Rapidité

Coût

Nécessaire pour estimer les données de FIV

Pas de mesure de la « fonction biologique » du sperme : la fécondation.

Pas d’estimation de l’effet des transgènes sur l’efficacité de la cryoconservation

Données de revitalisation incomplètes 

Faible à moyen

insuffisant

Fécondation In-Vitro (FIV) : Taux de fécondation in vitro

Mesure de la capacité de fécondation du sperme après congélation :

Décongélation d’une paillette de sperme

Mise en contact d’ovocytes frais et de sperme décongelé

Après 24H00 d’incubation, évaluation du nombre d’ovocytes fertilisés et divisés au stade 2C

Résultat en % d’embryons au stade 2 cellules

Mesure du maintien de la fonction biologique

Données principales de revitalisation

Estimation partielle de l’effet du transgène sur la cryoconservation

Haute

Oui

(voir QC1 « In-vito »)

Naissance des animaux de la lignée : taux de naissances

Vérification de la capacité de la lignée à générer des animaux post FIV :

QC Fécondation in-vitro

réimplantation d’embryons divisés dans des femelles pseudo-gestantes

Résultat en % de petits nés

Mesure de la fonction biologique

Evaluation plus complète de l’effet du transgène

Données de revitalisation complète

Plus long et plus coûteux

Evaluation complète du transgène à voir

Très Haute

En fonction des lignées

(Voir QC2 « in-vivo ») génotypage des petits conseillé si nécessaire

 

Comment interpréter un QC pour le sperme ?

Un QC1 in vitro vous donne le pourcentage d’embryons fécondés et développés au stade 2 cellules après FIV. Sur le tableau FAQ 23, il est possible d’apprécier le résultat moyen par souche avec le JAX™ Sperm Cryo Kit. Sur la base du pourcentage d’embryons au stade 2 cellules obtenus, et en fonction du fond génétique et du transgène, le QC sera classé en :

  • Recongeler
  • Revitalisable
  • Correct
  • Bon
  • Excellent

Lors de la revitalisation, et en fonction des résultats de contrôle qualité obtenu précédemment, nous adapterons le nombre de gouttes de sperme décongelées : 1 seule pour un QC bon ou excellent, plusieurs pour un QC délicat. Ce QC est donc bien important car il permet de connaitre les conditions de revitalisation (notamment la quantité d’ovocytes). Lors du transfert d’embryons, environ 40 à 50% des embryons issus du QC donneront des petits (Voir FAQ 12).

Exemple : Cryoconservation d’une lignée génétiquement modifiée sur fond C57Bl/6JRj : QC1 à 25%. Le rapport de QC pour cette cryoconservation est « Bon ». Ce résultat valide donc la cryoconservation de votre lignée.

Lorsque vous souhaiterez revitaliser votre lignée pour faire repartir une colonie, vous aurez besoin d’environ 3 à 5 couples. Sur le tableau de transfert d’embryons (Voir FAQ 12) pour la souche C57Bl/6JRj (attention il peut y avoir un effet du transgène) nous avons environ 50% (50 petits obtenus pour 100 embryons transférés).  Voici donc les données de revitalisation propres à votre lignée :

  • 1 goutte de 10ml d’une paillette de sperme décongelé, FIV avec 80 ovocytes
  • Sur ces 80 ovocytes, 20 donneront des embryons au stade 2 cellules (QC1 à 25%)
  • Le transfert de ces 20 embryons en femelles porteuses donnera donc 10 petits (50%)

Un QC2 « in-vivo », nous donne le nombre de petit obtenus après FIV à partir du sperme congelé. Dans ce cas, toutes les données sont connues et réajustables lors d’une revitalisation de lignée. En effet, grâce à ce contrôle qualité, nous obtenons un % de petits nés en fonction du nombre d’embryons obtenus de la FIV. Par ailleurs, ce QC permettra, en fonction du génotype des mâles donneurs, de contrôler le génotype des petits obtenus, et ainsi de s’assurer qu’ils sont bien porteurs du ou des transgènes et qu’il ne s’agit pas d’animaux sauvages (voir FAQ 9).

Pour reprendre l’exemple ci-dessus, le QC « in vivo » apportera le résultat de 50% de petits nés suite au transfert d’embryons, tout en prenant en compte les effets éventuels de la modification génétique. 

 

Les contrôles qualité (QC) pour la cryoconservation d’embryons

Ce tableau résume les avantages et les inconvénients de chaque contrôle qualité.

Contrôle qualité

Principe/procédure

Avantages

Inconvénients

(risque à évaluer)

Sécurité du QC

Conseils JANVIER LABS

Observation des embryons à la décongélation

Décongélation d’une paillette

Observation de la viabilité

Rapidité

Coût

Pas de mesure de la « fonction biologique » soit développement embryonnaire

Pas d’estimation de l’effet des transgènes sur l’efficacité de la cryoconservation

Données de revitalisation incomplètes

Faible

insuffisant

Culture In-Vitro

Après congélation, mesure la capacité des embryons à se développer pendant 24 H en culture :

Décongélation d’une paillette d’embryons

Observation des embryons à la décongélation : nombre d’embryons viables par rapport au nombre d’embryons décongelés (exprimé en %)

Culture in vitro 24 heures

Résultat en % d’embryons au stade 4-8 cellules

Mesure du maintien de la fonction biologique aux premiers stades préimplantatoires

Données partielles principales de revitalisation

Estimation partielle de l’effet du transgène sur la cryoconservation

Haute

Oui

(voir QC1 « In-vito »

Naissance des animaux de la lignée

Après congélation, vérification de la capacité des embryons à générer des animaux :

réimplantation des embryons après décongélation dans des femelles pseudo-gestantes.

Résultat en % de petits nés

Mesure de la fonction biologique (tout le développement dont la gestation)

Evaluation plus complète de l’effet du transgène

Données de revitalisation complètes

Plus long et plus coûteux

Evaluation complète du transgène jusqu’à la naissance

Très Haute

En fonction des lignées

(Voir QC2 « in-vivo ») génotypage des petits conseillé si nécessaire

 

Comment interpréter un QC pour l’embryon ?

Le QC1 pour cryoconservation d’embryons fournis l’information de l’efficacité de la cryoconservation avec la reprise d’un développement embryonnaire. Nous considérons qu’un QC est valable s’il est supérieur à 50% (50% des embryons congelés au stade 2 cellules se sont développés au stade 4-8 cellules). Ceci valide donc la cryoconservation, mais il faut savoir qu’en moyenne JANVIER LABS est entre 70 et 80% (voir FAQ 22).

Lorsqu’il sera nécessaire de faire une revitalisation, les embryons seront après décongélation directement transférés en femelle pseudo-gestante (comme pour un QC2). Si un QC2 a été fait, ces données pourront donc être directement utilisables ; si un QC1 a été fait, la garantie du développement permet de s’assurer des critères de revitalisation avec le fait que 70 à 80% des embryons sont viables et 50% de ces embryons donneront des petits (voir FAQ 12).

Pour exemple si je souhaite revitaliser 10 petits pour faire repartir ma lignée :

  • Je décongèle environ 25 embryons et j’aurais donc 20 embryons viables (80%)
  • Je transfert ces 20 embryons et j’obtiendrais environ 10 petits (50%)

 

JAX™ is a trademark of the Jackson Laboratory registered in the United States. All rights reserved.

 

26. Quel est le délai d’utilisation du JAX™ Sperm Cryo Kit ?

Seul le milieu cryoprotectant est périssable. Ce milieu vous est livré avec le Kit, et doit être stocké à -80°C dès son arrivée, et jusqu’à utilisation.

A la livraison, le milieu a une durée d’utilisation de 12 à 16 mois.

 

JAX™ is a trademark of the Jackson Laboratory registered in the United States. All rights reserved.

 

27. De quelle façon dois-je stocker le JAX™ Sperm Cryo Kit ?

Les flacons de milieu doivent être stockés à -80°C dès leur réception. Le reste du Kit doit être stocké à température ambiante. Veillez à ne rien jeter de ce Kit, chaque composant sera utilisé lors de la cryoconservation (notamment la boite polystyrène et le flotteur, indispensables à la congélation du sperme).

 

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28. Quelles sont les compétences requises pour cryoconserver moi-même mes lignées avec le JAX™ Sperm Cryo Kit ?

Il n’y a pas de compétences spécifiques pour cryoconserver soi-même sa lignée avec le JAX™ Sperm Cryo Kit. Il convient juste d’avoir une expérience dans la dissection et biopsie d’organe chez la souris et de manipulation simple de laboratoire. Ceci dit, il est nécessaire de s’entrainer au préalable et notamment pour la dissection des queues d’épididymes et des canaux déférents, étape cruciale pour une bonne congélation. De plus, le  JAX™ Sperm Cryo Kit est fourni avec un lot de paillettes « Practice ».

 

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29. Quelle technique de FIV utiliser avec le JAX™ Sperm Cryo Kit ?

Si vous avez les compétences et souhaitez faire vos contrôles qualité ou revitalisations, cela est possible, mais il convient de connaitre les paramètres et protocoles de FIV à utiliser. Le Jackson laboratory a développé ce Kit dans le but de simplifier et d’optimiser la FIV et recommande la technique publiée dans l’article relatif au Kit (Ostermeier et al., 2008). Aujourd’hui, il existe une technique alternative de FIV mise au point par l’équipe de N. Nakagata (Takeo et Nakagata, 2011). Cette technique est plus complexe, plus coûteuse et nécessite des ajustements. Elle est toutefois, plus performante dans certaines conditions. Si l’on considère les différentes étapes de revitalisation à partir du sperme congelé et les variations de résultat notamment dues à la gestation des femelles porteuses, nous conseillons d’utiliser, dans la majorité des situations, la technique simple publiée en 2008 (Ostermeier et al., 2008). En effet, au final, l’obtention de souris pour redémarrer une colonie sera sensiblement identique entre les 2 techniques. Le Kit est compatible avec la FIV décrite par Nakagata (Nakagata et al., 2014). Si vous souhaitez des conseils et les différentes méthodes de FIV à partir de sperme congelé par le  JAX™ Sperm Cryo Kit, n’hésitez pas à nous contacter à myproject@janvier-Labs.com.

 

 

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30. Puis-je utiliser le JAX™ Sperm Cryo Kit pour congeler toutes les souches de souris ainsi que d’autres espèces mammifères? 

Le JAX™ Sperm Cryo Kit a été optimisé pour la congélation de sperme de souris, et ne fonctionne pas pour le rat. Le sperme de toutes les souches de souris couramment utilisées peut être cryoconservé. Cependant, certaines souches de souris montrent des taux de fertilisation aléatoires après congélation (Ostermeier et al., 2008, see figure FAQ 23).

 

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31. Combien de temps je peux conserver le sperme ou l’embryon dans l’azote liquide ? 

La cryoconservation de matériel issue de souris de laboratoire a débuté, il y a plus de 40 ans et aujourd’hui elle est largement implantée dans les instituts (pour revue voir : Mo Guan et al., 2012). Connaitre et avoir du recul sur la durée de stockage en azote liquide est donc primordial. Si nous considérons que la cryoconservation de sperme ou d’embryons a été correctement effectuée, il est possible en théorie de les conserver indéfiniment. Sur le plan pratique, il y a un recul d’une quinzaine d’années sur la cryoconservation de sperme et de plus de 30 ans pour la cryoconservation d’embryons (Glenister et al.,1984 ; Kaneko et al., 2006, Leibo et al., 1994 ; Riggs et al., 2010).

 

32. J'ai une paillette de sperme congelé. Pouvez-vous effectuer la décongélation et expédier les animaux revitalisés à mon laboratoire ou à celui d’un collaborateur? Une seule paillette est-elle suffisante pour obtenir le nombre d’animaux nécessaires au redémarrage d’une colonie ?

Oui, si le sperme a été congelé avec le JAX™ Sperm Cryo Kit, et que le contrôle qualité est supérieur à 5%, nous garantissons la revitalisation de votre lignée. Une paillette de sperme permettra d’obtenir les 3 à 5 couples de reproducteurs nécessaires au démarrage de la lignée. Si une autre méthode de congélation a été utilisée, ou si vous ne disposez pas de résultats de contrôle qualité, nous tenterons la revitalisation. Au moins 2 paillettes seront nécessaires dans ce cas.

 

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33. Comment puis-je vous faire parvenir des paillettes de sperme ou d’embryons congelés (pour stockage ou contrôle qualité par exemple) ?

Pour rapatrier vos paillettes sur notre site, nous pouvons vous livrer et récupérer un dry shipper prêt à l’emploi par notre propre service transport ou mandater un transporteur spécialisé dans le transport de matériel biologique congelé.

 

34. Je souhaite obtenir une lignée appartenant à un collaborateur d’un autre institut et dont les paillettes de sperme ou d’embryons sont en stockage chez JANVIER LABS, comment procéder ?

Afin d’obtenir une lignée appartenant à un collaborateur, celui-ci doit nous faire parvenir son accord écrit soit sous forme d’email, soit par le biais d’une attestation de cession de matériel biologique que nous fournissons afin de préciser les conditions de la cession (nom de la lignée, nom du collaborateur, nombre de paillettes etc…).

 

35. J'ai des paillettes de sperme ou d’embryons en stockage chez JANVIER LABS. Que dois-je faire lorsque le stockage arrive à son terme ?

Peu avant que le stockage n’arrive à son terme, vous recevez un email vous informant de la date de fin de stockage. Vous pourrez, si vous le souhaitez, solliciter sa prolongation.

Si besoin, nous vous ferons parvenir un devis pour cette prolongation de stockage.

 

36. Quelles sont les conditions de stockage de mes paillettes de sperme ou d’embryons chez JANVIER LABS ?

Les paillettes de sperme ou d’embryons des lignées de nos clients sont stockées en immersion totale dans l’azote liquide, sur deux sites indépendants distants de 8 kms ; la distance géographique nous permettant de vous garantir une plus haute sécurité quant à la conservation de votre matériel biologique.

Un système de contrôle avec alarme nous permet de surveiller les conditions du cryostockage.

 

37. L'utilisation du Quickblasto® pour mes injections de cellules ES est-elle compliquée ?

Non, un manuel d'utilisation simple et détaillé est fourni avec le kit, il est accessible à toute personne ayant fait de la micromanipulation d'embryons aux stades préimplantatoires.

 

38. Comment puis-je estimer le nombre de paillettes à décongeler pour avoir suffisamment de blastocystes receveurs pour mes injections de cellules ES ?

Le Quickblasto® vous permet d‘avoir, à partir d’embryons congelés, des blastocystes receveurs des cellules souches embryonnaires. Le tableau suivant vous présente les performances moyennes enregistrées à chaque étape pour les 2 souches les plus couramment utilisées dans la création de souris génétiquement modifiées réalisée avec le Quickblasto®.

A partir de ces données il est possible de planifier des injections et notamment d’estimer le nombre de paillettes/embryons à décongeler.

Par exemple : si vous souhaitez 6 souris chimères par clone injecté en utilisant des blastocystes C57BL/6NRj:

Les portées devront représenter un total d’environ 10 petits (60% de chimères).

Pour cela vous devrez transférer en femelles pseudogestantes environ 30 blastocystes (31.8% de taux de naissance) : nous conseillons le transfert de 14 blastocystes (en bilatéral) par femelle pseudogestante soit 2 femelles dans notre exemple.

Il vous faudra décongeler environ 50 embryons soit 2 paillettes pour obtenir environ 30 blastocystes à transférer (67.4% de taux de développement. Veillez à prévoir la perte lors de l’injection).

 

 

39. Comment puis-je obtenir des informations sur l'évolution de mon projet en élevage à façon ?

Pour toutes les prestations d’élevage à façon, une interface client (AniBio) permet de visualiser l’ensemble des animaux (http://anibio.janvier-labs.com/Default.aspx). Cette interface client ne nécessite aucune installation (uniquement une connexion Internet) et est disponible 24h/24 – 7j/7. L’interface vous permet d’agir directement sur vos animaux en transmettant des consignes (accouplement, mise à mort, choix des animaux à expédier…). Il est aussi possible d’attribuer vous-même le génotype de vos animaux après avoir effectué vos analyses de génotypage. Cet outil permet également de garder une traçabilité de l’ensemble de vos colonies, des demandes de services associés et d’estimer les coûts associés à vos demandes de services.

Si toutefois vous souhaitez obtenir des informations complémentaires au cours du projet, vous pourrez en faire la demande par email à myproject@janvier-labs.com ou par téléphone au +33.(0)2.43.02.90.28. 

 

40. Quel type d'élevage à façon proposez-vous en fonction du génotype de mes animaux ?

JANVIER LABS propose l’élevage à façon de rongeurs transgéniques, ce qui implique dans certains cas, de marquer les individus et de faire une biopsie pour permettre le génotypage des animaux transgéniques. Ces biopsies peuvent vous être expédiées pour que vous réalisiez le génotypage ou bien JANVIER LABS peut s’occuper d'effectuer le génotypage pour vous.

Voici donc les types d’élevage à façon que nous proposons pour les rongeurs (rats et souris) : 

 

Elevage SPF en IVC

(Individual Ventilated Cages)

Elevage SOPF en isolateur

Services

Elevage en cages ventilées

Elevage en isolateur

Contrôle sanitaire SPF

Contrôle sanitaire SOPF

 Accouplements 

 Sevrages 

 Gestion de la colonie via un logiciel (AniBio)

dédié à l'élevage à façon (disponible 24h/24 - 7j/7)

Suivi et support scientifique du projet

par un responsable projet dédié

Options

Rapatriement d'animaux

 Décontamination préalable de la lignée

 Identification (par transpondeur, à l'oreille, ou autre)*

 Biopsies (queue ou oreille)*

Génotypage par PCR,

établissement d'un protocole de génotypage

Expéditions d'animaux selon les besoins (âge, sexe, génotype)

sur la base de lots prédéfinis ou en fonction des disponibilités

 

* Dans le cas d'identification, les animaux sont marqués par transpondeur (puce électronique) et des biopsies sont réalisées. Ce système peut être utilisé si vous génotypez vous-même les animaux ou si nous effectuons le génotypage pour vous. Il est intéressant de savoir que le marquage est possible sur les petits dès 10 jours. Ceci permet d'obtenir des résultats de génotypage avant le sevrage et donc de ne conserver que les animaux d'intérêt, ce qui réduit le nombre de cages d'élevage.

 

 

41. Pour l'élevage à façon, comment savoir le nombre de petits nés / sevrés, la date de naissance des petits, le sexe... ?

Toutes ces informations sont disponibles dans le logiciel d'élevage à façon (AniBio) : http://anibio.janvier-labs.com/Default.aspx

 

42.  Comment savoir si une demande a été réalisée dans AniBio ?

Toutes les demandes peuvent être suivies dans le logiciel AniBio (date de la demande, animaux impliqués, personnel ayant pris en charge la demande, état de la demande, date de réalisation...).

http://anibio.janvier-labs.com/Default.aspx 

 

43. Est-il possible de faire des protocoles sur mes animaux en élevage à façon ?

Oui vous pouvez nous soumettre toutes vos demandes, (par exemple :prélèvements de sang, d’organes, chirurgie…). Contactez-nous à myproject@janvier-labs.com. Nous établirons un devis conformément à vos besoins.